C18反相色谱柱是一种高效液相色谱柱，在药物分析、环境监测、食品安全检测等领域有着广泛的应用。利用反相色谱技术，其原理是表面修饰成疏水性的碳链（C18链）与待测物通过疏水作用相互作用，实现对待测物的分离和纯化。具体来说，C18反相色谱柱内部填充有一定大小和形态的颗粒，表面涂层有一层碳链和疏水基团。样品在经过样品预处理后，通过进样器注入色谱柱中，在柱内填充的颗粒表面发生反相作用，非极性物质向柱内靠拢，极性物质则排斥柱内颗粒而向外逸散。通过改变流动相的极性和离子强度等条件，可以实现对待测物的选择性分离和纯化。
1、准备工作：
检查仪器设备是否正常运行，确保柱子处于良好状态。准备好所需的溶剂和移动相。
新柱在使用前需进行处理。配制好65%的乙腈/水溶液，将色谱柱正确连接在色谱仪上，出口放空（注意出口端不可连上检测器，以免污染），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min进行冲洗，等看见柱子出口有液体流出后，过20分钟再接上检测器，以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min，继续冲洗2~8小时。
2、样品制备：
将待测样品溶解于适当的溶剂中，并进行必要的预处理，如过滤、离心等。
3、柱子装填：
将C18反相柱装入色谱柱架中，连接好进样系统和检测器。
4、初始条件设置：
设置移动相组成和流速，一般采用梯度洗脱方法，即开始时使用较弱的极性溶剂，逐渐改变为较强的极性溶剂。
5、进样：
将样品通过进样系统注入柱中，注意保持稳定的进样流速。
6、色谱分离：
开始进行色谱分离，根据需求调整流速和梯度条件，使不同组分得到有效分离。
7、数据采集和解析：
利用检测器对柱出口的化合物进行检测和记录，获取相应的色谱图。
8、结果分析：
根据色谱图进行结果分析，确定目标化合物的峰位置、峰高、峰面积等参数。
9、色谱柱清洗：
如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相，做完样品后可直接用55%~65%乙腈/水或55%~65%甲醇/水冲洗色谱柱40~80分钟，然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存。
如果样品分析中流动相里含有缓冲液或酸或离子对试剂，做完样品后需先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水冲洗一小时以上（如果色谱柱更长，则还需增加适当时间），然后用55%甲醇/~水65%/水冲洗色谱柱30~60分钟，最后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗30分钟。
10、色谱柱再生：
当色谱柱使用较长时间后出现柱压力升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况时，可进行再生。先用5%甲醇/水或5%乙腈/水反向冲洗60分钟以上，然后用四氢呋喃以1ml/min流速冲洗30分钟以上，再用65%甲醇/水或65%乙腈/水以1ml/min流速冲洗60分钟，最后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存即可。
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